Desenvolvimento de uma construção gene repórter para a localização subcelular

A RNA pirofosfohidrolase (RppH) inicia a degradação das transcrições através da remoção do pirofosfato da extremidade 5' dos mRNAs, o que permite a ligação da RNase E/RNase J nas bactérias. Uma suposta RNA pirofosforilase está presente nas células de C. reinhardtii e várias evidências sugerem que a proteína está envolvida na degradação do mRNA no cloroplasto. A fim de determinar a localização da proteína nas células de Chlamydomonas, a extremidade 5' do gene rppH foi marcada com uma proteína fluorescente verde com codões otimizados e introduzida nas células de Chlamydomonas. A GFP (Zsgreen 1) foi otimizada em termos de códons utilizando uma base de dados de utilização de códons. O quadro de leitura da GFP sintética otimizada foi ajustado e clonado no vetor pBluescript-5'rppH SK+. O fragmento do gene 5'rppH-GFP foi então clonado em três vetores. Todas as construções foram verificadas. Os transformantes foram selecionados quanto à presença do gene GFP quimérico por PCR. As experiências de triagem levaram-nos a escolher um transformante que pudesse ser utilizado para trabalhos futuros. Além disso, embora a fluorescência não tenha sido verificada, a GFP sintética otimizada foi expressa em células de E. coli (BL21DE3), confirmando a funcionalidade da construção da GFP sintética in vivo.